Mit Ihrer Veröffentlichung `Coffee – a ubiquitous substitute for uranyl acetate in staining of biological ultrathin sections for electron microscopy studies’ haben Forscher rund um Claudia Mayrhofer einige Wellen in diversen Veröffentlichungen geschlagen. Wir haben das folgende Gespräch mit der Claudia geführt und nachgefragt.

Claudia Mayrhofer hat nach einer HTL-Ausbildung (höhere Technische Lehranstalt) zur Elektrotechnikerin und einem angefangenen Chemiestudium, in der Papierindustrie gearbeitet, bis sie 2003 eine Stelle an der Technischen Universität Graz in der Elektronenmikroskopie angetreten hat. Dort entdeckte sie Ihre Leidenschaft für die Ultramikrotomie, die sie bis heute verfolgt.

Wie seid ihr eigentlich auf die Kaffee-Kontrastierung gekommen?
Der Auslöser war das Verbot von Uranylacetat im Jahr 2019 in unserem Labor. Es war für uns nicht mehr bestellbar, die Lagerung wurde immer komplizierter, und die Entsorgungskosten sind explodiert. Also brauchten wir eine Alternative!
Zuerst verwendeten wir Platinblau, aber das ist fast noch giftiger als Uranylacetat und das wollte ich meinen Studenten und Kollegen nicht zumuten.
Dann kam die Idee mit OTE (Oolong Tea Extract), aber während der Corona-Pandemie war das hochreine Extrakt nicht zu beschaffen.
So saß ich eines Tages im Labor und sah die eingetrockneten Kaffeetassen meiner Kollegen – und dachte: Wenn Tee funktioniert, warum nicht Kaffee? Beide enthalten ähnliche Gerbstoffe. Also habe ich kurzerhand den Kaffeesatz verwendet, um damit Algen aus meinem Aquarium zu kontrastieren, und siehe da: Es hat sofort geklappt!
Der erste Test war so erfolgreich, dass ich es mit frisch gebrühtem Kaffee wiederholt habe – und das Ergebnis war noch besser. So fing alles an!“

Wie lange habt ihr an dem Projekt der Kaffee-Kontrastierung gearbeitet?
Das war ein langer Prozess! Nach den ersten erfolgreichen Tests mit Algen versuchten wir die Methode wissenschaftlich zu validieren. Hierfür hat unser Masterstudent Robert Zandonella ein Matlab-Programm entwickelt, um die Kontrastierung an Mitochondrien objektiv zu bewerten, da diese besonders gut zu vermessen sind. Der Schwerpunkt lag auf der Anwendung und Bewertung verschiedener alternativer Färbemittel als Vergleich. Die klassische Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat nach Reynolds diente dabei als Referenzmethode.
Pro Mitochondrium wurden zehn Punkte analysiert, um subjektive Eindrücke auszuschließen. Das war entscheidend, denn ein subjektiv gutes Ergebnis sagt noch nichts über die Reproduzierbarkeit aus. Die Masterarbeit dauerte einige Zeit und wir haben darin die relevanten Bestandteile systematisch verglichen.
Der Publikationsprozess war unerwartet zäh, nicht zuletzt wegen der unkonventionellen Methode und der anfänglichen Schwierigkeit, einen zweiten Reviewer zu finden. Aber jetzt ist das Paper endlich draußen, und die Resonanz ist größer, als ich je erwartet hätte.

Welcher Stoff im Kaffee ist für die Kontrastierung verantwortlich?
Nach der ersten erfolgreichen Kontrastierung war die erste Überlegung den Kaffee auf Schwermetalle zu testen, was ja eigentlich nicht sein konnte, aber, man weiß ja nie, wie Kaffee behandelt wird.
Nachdem dieser Test negativ ausgefallen ist, haben wir die Kaffeebestandteile analysiert und die Chlorogensäure als maßgeblichen Faktor für die gute Kontrastierung identifizieren können.

Welche Bohne oder welche Röstung funktioniert am besten?
Das ist eine Wissenschaft für sich! Wir haben verschiedene Bohnen und Röstungen ausprobiert. Und ja, es gibt Unterschiede! Ungerösteter, grüner Kaffee funktionierte am besten, ist aber extrem schwer zu verarbeiten. Die Bohnen müssen gerieben, gekocht und gefiltert werden, jedoch ist der Extrakt so inhomogen, das jeder Spritzenfilter sofort verstopft. Für den Alltag ist das also keine Option.
Standard-Kaffee wie Arabica variiert zu stark: Mal ist die Röstung heller, mal dunkler, mal ist er stärker oder schwächer gebrüht. Für wissenschaftliche Arbeiten braucht man aber konstante Bedingungen. Daher verwenden wir den Kaffee-Extrakt nur für Vorversuche.

Wie reproduzierbar ist die Kaffee-Kontrastierung?
Hier zeigt sich der große Unterschied zwischen Kaffee-Extrakt und der reinen Chlorogensäure! Der Extrakt ist eine tolle, schnelle Lösung, die Ergebnisse sind jedoch extrem variabel. Wie schon gesagt: je nach Bohne, Röstung oder sogar Wassertemperatur beim Brühen ändert sich die Zusammensetzung des Konzentrats. Das ist für die Reproduzierbarkeit im wissenschaftlichen Arbeiten ein großes Problem. Deshalb haben wir uns auf die Chlorogensäure konzentriert. Sie ist als Chemikalie verfügbar, stabil und liefert reproduzierbare Ergebnisse. Noch besser: Mit Chlorogensäure kontrastierte Proben waren nach 1,5 Jahren immer noch einwandfrei – während mit Uranylacetat oder Kaffee-Extrakt kontrastierte Proben Präzipitate zeigten.

Welche Vorteile hat Kaffee/Chlorogensäure gegenüber Tee?
Tee bzw. OTE funktioniert zwar auch, aber Kaffee-Extrakt und Chlorogensäure zeigt bessere Ergebnisse! Die Kontraste sind schärfer. Mit OTE, den wir nachträglich besorgten, zeigt im Gegensatz zu Kaffee starke Präzipitationen, die wir nicht losbekamen.

Welche Proben funktionieren und welche nicht?
Bisher haben wir Chlorogensäure erfolgreich bei Algen, Hefe, Niere (Ratte), Leber (Maus) und Zebrafisch eingesetzt. Besonders bei biologischen Proben wie Algen oder Hefe ist der Kontrast bemerkenswert. Weniger gut haben Negativkontrastierungen funktioniert. Für Kunststoffe, wie Polymere sehe ich weniger Potenzial, da dafür Uranylacetat ohnehin kaum genutzt wird.
Leider können wir nur eingeschränkt mit nativen tierischen oder humanen Geweben arbeiten, da uns hierfür die Zulassung am Institut fehlt. Das ist schade, denn gerade für die Biologie sehen wir in der Chlorogensäure großes Potential. Hier fehlen uns noch Kooperationen mit anderen Laboren, die entsprechende Proben präparieren dürfen. Vielleicht ergibt sich ja ein Projekt über das Netzwerk an EM-Laboren!

Verwendet ihr Kaffee-Extrakt und Chlorogensäure regelmäßig in eurer Facility?
„Ja, absolut! Für erste Tests oder schnelle Kontrastierungen nutzen wir den Kaffee-Extrakt, der ist günstig und funktioniert gut. Für wissenschaftliche Projekte oder Langzeituntersuchungen verwenden wir aufgrund der Reproduzierbarkeit Chlorogensäure und auch bei bereits etablierten Proben wie Algen oder Hefe.
Bei neuen Proben testen wir immer beide Varianten – aber Chlorogensäure gewinnt fast immer. Und das Schönste: Die Studenten lieben es, weil sie nicht mit gefährlichen Chemikalien arbeiten müssen!“

Welche Unterschiede gibt es im Vergleich mit Uranylacetat?
Der größte Unterschied ist die Reinheit der Proben! Uranylacetat hinterlässt nach der Kontrastierung häufig Präzipitate, auch nach sorgfältigem Waschen. Chlorogensäure nicht. Zudem zeigen mit Chlorogensäure kontrastierte Proben eine höhere Langzeit-Stabilität: Nach Monaten Lagerung waren Chlorogensäure-Proben immer noch makellos, während Uranylacetat-Proben bereits Verunreinigungen zeigten. Außerdem bildet Chlorogensäure aus meiner Sicht stärkere Kontraste: Konturen von Mitochondrien oder anderen Strukturen wirken klarer. 

Und der größte Pluspunkt: Chlorogensäure ist ungiftig und dadurch eine echte Erleichterung und wie es aussieht ohne Kompromisse bei der Qualität.“

Ist es das Ende der Entwicklung oder wohin geht die Reise noch?
Auf keinen Fall ist es das Ende! Im Gegenteil: Ich möchte die Methode für die Negativkontrastierung weiterentwickeln. Das haben wir ein paar Mal versucht, hat aber wie schon erwähnt nicht immer funktioniert. Hier sehen wir noch viel Optimierungspotential. Dafür benötigen wir mehr Gewebeproben und vor allem Partnerlabore, die uns mit Proben unterstützen oder parallel Versuche durchführen können. Mein Traum wäre ein großes Netzwerk von Laboren, die gemeinsam testen, vergleichen und die Methode etablieren. Vielleicht ergibt sich etwas über die Community und Meetings.

Die Reise hat gerade erst begonnen – und ich bin gespannt, wohin sie führt!“

Du leitest ja auch Ultramikroskopie-Workshops – wie kann man mehr erfahren? Und gibt es auch Kurse für Coffee-Staining?
Am ZFE (Zentrum für Elektonenmikroskopie) bieten wir individuell zugeschnittene Ultramikrotomie-Kurse an, sowohl für interne als auch externe Teilnehmer. In der Vergangenheit waren das oft Kurse mit 10 oder mehr Teilnehmern. Aufgrund der Probenvielfalt im biologischen und Materialbereich und deren Herausforderungen haben wir festgestellt, dass das nicht zielführend ist.

Deshalb mache ich jetzt maßgeschneiderte Schulungen: Entweder kommen die Kunden zu uns, oder ich fahre zu ihnen und arbeite direkt an ihren Geräten. Das ist viel effektiver!
Spezifische Coffee-Staining-Kurse gibt es noch nicht, aber ich bin offen für Anfragen. Besonders spannend wäre ein Ringversuch mit anderen Laboren, um die Methode breiter zu testen. Wer Interesse hat, kann mich einfach kontaktieren – wir finden sicher eine Lösung!

Übrigens: Wer einen Kurs bei mir bucht, bekommt das neue Ultramikrotomie-Buch „ Ultramikrotomie in den Material- und Biowissenschaften“ geschenkt – da steckt auch ein Kapitel von mir und Helmut Gnägi drin!“

Claudia, vielen Dank für das Gespräch!