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Array-Tomographie

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      Computergesteuertes PT3D Ultramikrotom mit Bildausgabe. Das PT3D hat einen einzigartigen Vorschub von 1000µm zum kontinuierlichen Schneiden ultra-dünner Schnitte. Es wurde speziell entwickelt für 3D-Rekonstruktionen mittels Array Tomographie oder für Kryo-Projekte, für die ein hohes Maß an Trimmen erforderlich ist. Die patentierte PowerDrive®-Technologie, eine motorisierte Unterstützung der Schneidebewegung, unterstützt zudem das Schneiden harter, großer Proben.

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        Das ATUMtome von RMC, ein Ultramikrotom mit integriertem Schnittsammler für die Aufnahme von Serienschnitten. Entwickelt an der Harvard Universität im Labor von Jeff Lichtman. Das ATUMtome ist ein einzigartiges Gerät zur Aufnahme von Serien ultradünner Schnitte auf einem Trägerband. Anschließende Datenerfassung erfolgt im REM, z.B. für 3-D-Rekonstruktionen (Array-Tomographie).

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          Der ASH 2 Substrathalter für die Ultramikrotomie ermöglicht das effiziente Sammeln von hunderten ultradünnen Schnitten direkt auf ein Substrat für die Datenaufnahme mittels Licht- oder Rasterelektronenmikroskopie. Der Halter kann direkt an den Messerhalter eines RMC PowerTome Ultramikrotoms montiert werden.

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            Das DiATOME ultra ats wurde entwickelt, um Serien ultra-dünner Schnitte auf ein Substrat, wie z.B. ITO-beschichtete Objektträger oder Siliziumwafer zu übertragen. Mittels Array-Tomographie können anschließend am REM 3D-Datensätze der Schnittserien aufgenommen werden. Die große Messerwanne ist mit einem Wasserablauf auf der Unterseite ausgestattet.

          Array Tomography

          Konnektomik - die Erschließung der Gesamtheit der neuronalen Verbindungen eines Nervensystems - war die treibende Kraft für die Entwicklung von 3D-Bildgebungsverfahren in der Licht- und Elektronenmikroskopie. Selbst hochauslösende lichtmikroskopische Verfahren, wie die Fluoreszenzmikroskopie (STED, PALM, STORM) stoßen an Ihre Auflösungsgrenzen, um Strukturen für eine detaillierte Rekonstruktion neuronaler Systeme einschließlich synaptischer Verbindungen abbilden zu können.


          Aufgrund der Auflösungsgrenzen der Lichtmikroskopie wurde nach Techniken geforscht, die in der Lage sind, neuronale Konnektivität mit ausreichender Auflösung darstellen zu können. Auf der Basis der Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden in den letzten Jahren folgende Techniken entwickelt und optimiert, die die Anforderungen der Konnektomik erfüllen: Serial Block Face Scanning EM (SBFSEM), Array-Tomographie (AT) und Focused Ion Beam (FIB).

          Array Tomographie

          Die Array-Tomographie ist ein Verfahren, mit dem 3D-Datensätze ultra- oder semi-dünner Schnitte einer Gewebeprobe erfasst werden können. Die Probe wird hierfür mit einem Ultramikrotom geschnitten, die Schnittserie auf einem Substrat gesammelt und anschließend mit einem REM aufgenommen. Je nach Forschungsprojekt sind kleinere oder größere Schnittserien erforderlich, um die gewünschte Region vollständig zu rekonstruieren.

          Im Vergleich zu SBFSEM und FIB, ist die Array-Tomographie eine nicht-destruktive Technik. Gesammelte Schnittserien können eingelagert werden, und zu einem späteren Zeitpunkt erneut - falls gewünscht - mit unterschiedlicher Auflösung, an anderen Regionen und ggf. mit anderen Techniken aufgenommen werden. Zudem ist eine Nachbehandlung der Schnitte, wie z.B. eine Nachkontrastierung mit Schwermetallen oder Fluoreszenzmarkierung für korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), möglich.

          Mittlerweile wird die Array-Tomographie nicht nur für die Konnektomik verwendet, sondern findet auch in anderen Wissenschaftsbereichen Anwendung, z. B. 3D-Rekonstruktion von Einzelzellen oder Organellen bis hin zur Rekonstruktion komplexer Materialien.

           

          Referenzen

          Q&A: Array tomography. Smith SJ; BMC Biol. 2018 Sep 6;16(1):98.

          A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Burel et al; Development. 2018 Jun 21;145(12).

          Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Wacker et al; J Vis Exp. 2018 Mar 20; (133). Video-Link.

          A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Kubota et al; Nat Commun. 2018 Jan 30;9(1):437.

          Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. Wacker et al. BMC Cell Biol. 2016; 17: 38.

          High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Mikula and Denk; Nat Methods. 2015 Jun;12(6):541-6.

          New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Kubota Y; Microscopy (Oxf). 2015 Feb;64(1):27-36.

          Array tomography. Wacker I and Schroeder RR; J Microsc. 2013 Nov;252(2):93-9.